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それでは内容に入っていきましょう‼
はじめに
低出力パルス超音波（Low Intensity Pulsed Ultrasound、以下LIPUS）は、骨折治療の分野において、長年にわたって臨床応用されてきた非侵襲的な治療法です。
1994年にアメリカ食品医薬品局（FDA）によって承認されて以来、多くの骨折患者さんに対して使用され、骨癒合の促進に一定の効果を示してきました[1]。
しかしながら、LIPUSがどのような細胞・分子メカニズムを通じて骨形成を促進するのかについては、長らく不明な点が多く残されていました。
近年の研究により、LIPUSが間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells、以下MSCs）の発生決定に深く関わっていることが明らかになってきました。
この記事では、LIPUSが持つ多面的な生物学的効果について、特にMSCsの脂肪細胞分化と骨芽細胞分化のバランス制御という観点から、最新の知見を交えながら解説させていただきます。
間葉系幹細胞の分化運命とその重要性
MSCsは、骨髄をはじめとする様々な組織に存在する多能性を持った細胞集団として知られています[2]。これらの細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞など、複数の系譜へと分化する能力を備えています。特に注目すべき点は、脂肪細胞への分化（脂肪分化）と骨芽細胞への分化（骨分化）が、相互に抑制的な関係にあるということです[3]。
この脂肪分化と骨分化のバランスは、骨の健康維持において極めて重要な意味を持っています。実際、このバランスが脂肪分化に傾くと、骨量の減少が生じ、骨粗鬆症などの病態につながることが報告されています[4]。高齢化社会を迎えた現代において、骨粗鬆症は深刻な社会問題となっており、MSCsの分化運命を適切に制御することは、予防医学的観点からも大きな意義を持つと考えられます。
LIPUSによる脂肪分化の抑制効果
LIPUSがMSCsに与える最も興味深い効果の一つが、脂肪分化の抑制作用です。
複数の研究において、LIPUS刺激を受けたMSCs由来細胞株や前駆細胞では、脂肪滴の形成が顕著に減少することが観察されています。
この脂肪分化抑制のメカニズムを理解する上で鍵となるのが、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ2（PPARγ2）という転写因子です。PPARγ2は、脂肪分化における「マスター制御因子」として知られており、この転写因子の発現と活性が脂肪細胞への運命決定を左右します[5]。
興味深いことに、LIPUSはPPARγ2の遺伝子発現レベルを低下させるだけでなく、PPARγ2タンパク質のリン酸化も促進することが明らかになっています。このリン酸化は、PPARγ2の転写活性を負に制御することが知られており[6]、LIPUSは遺伝子発現とタンパク質の翻訳後修飾という二重のメカニズムを通じて、脂肪分化を効果的に抑制していると考えられます。
さらに、脂肪分化に関わる他のマーカー遺伝子、例えば脂肪酸結合タンパク質4（FABP4）なども、LIPUS刺激によって発現が低下することが確認されています。これらの所見は、LIPUSが脂肪分化プログラム全体を包括的に抑制していることを示唆しています。
LIPUSによる骨分化の促進効果
脂肪分化を抑制する一方で、LIPUSは骨分化を積極的に促進する作用も持っています。この相反する二つの効果が同時に働くことで、MSCsの運命決定は骨芽細胞方向へと大きく傾くことになります。
骨分化の促進は、複数の指標によって確認されています。まず、細胞の石灰化が亢進することが観察されています。これは、骨形成の最終段階において重要なプロセスです。また、骨分化の主要な制御因子であるRunt関連転写因子2（Runx2）や、成熟骨芽細胞のマーカーであるオステオカルシンのmRNA発現が、LIPUS刺激によって有意に上昇することが報告されています。
Runx2は、骨分化における中心的な転写因子として機能し、骨芽細胞への分化に必要な遺伝子群の発現を制御しています[7]。興味深いことに、Runx2は骨分化を促進するだけでなく、脂肪分化を抑制する作用も持つことが知られており[8]、MSCsの運命決定における重要な分岐点として機能していると考えられます。
臨床的な観点から見ると、LIPUSが骨形成の全過程、すなわち炎症期、軟性仮骨形成期、硬性仮骨形成期、そしてリモデリング期のすべてにおいて有益な効果を示すことが、動物実験によって示されています[9]。特に、骨折部位におけるコラーゲンやアグリカンといったタンパク質の沈着を促進することが報告されており、これらは仮骨形成において重要な役割を果たしています。
シグナル伝達経路の解明：ROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK軸
LIPUSがこれらの多彩な生物学的効果を発揮する分子機序について、近年の研究により詳細なシグナル伝達経路が明らかにされてきました。この経路の理解は、LIPUSの作用メカニズムを解明する上で極めて重要です。
細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）の活性化
まず注目すべきは、LIPUSがERK（Extracellular signal-Regulated Kinase）と呼ばれるキナーゼを活性化することです。ERKは、細胞の増殖、分化、生存など、多様な細胞機能を制御する重要な分子として知られています[10]。
MSCsの分化においても、ERKシグナルは重要な役割を果たしています。特に、骨分化の過程において、ERKの持続的な活性化が観察されることが報告されており、この活性化が分化のタイミングと一致していることが示されています[11]。逆に、ERKの活性化を阻害すると、骨分化が抑制され、代わりに脂肪分化が亢進することが明らかにされています。
このことから、ERKシグナルはMSCsの運命決定において、骨分化を促進し脂肪分化を抑制する方向に働くスイッチのような役割を果たしていると考えられます。
Cot/Tpl2キナーゼの関与
では、LIPUSはどのようにしてERKを活性化するのでしょうか。この疑問に対する答えとして、Cot/Tpl2（Cancer Osaka thyroid oncogene/Tumor progression locus 2）キナーゼの関与が明らかにされました。
Cot/Tpl2は、セリン・スレオニンキナーゼの一種であり、本来は炎症性サイトカインの産生などに関わることで知られていた分子です。しかし、LIPUSの文脈においては、このキナーゼが機械刺激を生化学シグナルに変換する重要な中継点として機能していることが示されました。
具体的には、LIPUS刺激によってCot/Tpl2がリン酸化され活性化します。活性化されたCot/Tpl2は、次にMEK1（Mitogen-activated protein kinase kinase 1）をリン酸化し、MEK1がさらにERKをリン酸化することで、シグナルが伝達されていきます。
この経路の重要性は、Cot/Tpl2特異的阻害剤を用いた実験によって証明されています。Cot/Tpl2の活性を阻害すると、LIPUSによる脂肪分化の抑制効果も骨分化の促進効果も消失することが観察されており、Cot/Tpl2がLIPUSの効果発現に必須の分子であることが示されています。
Rho関連キナーゼ（ROCK）の上流制御
さらに上流に遡ると、ROCK（Rho-associated kinase）と呼ばれるキナーゼが、このシグナル伝達カスケードの起点として機能していることが明らかになりました。
ROCKは、細胞骨格の再編成や細胞形態の制御に関わることで知られるキナーゼです。機械刺激に対する細胞の応答において中心的な役割を果たしており、LIPUSのような物理的刺激を感知する上流のセンサーとして機能していると考えられます。
ROCK特異的阻害剤であるY-27632を用いた実験、あるいはROCK1に対するsiRNAを用いた遺伝子ノックダウン実験により、ROCKの活性化がCot/Tpl2のリン酸化に必須であることが示されました。ROCKの活性を阻害すると、Cot/Tpl2の活性化が抑制され、その下流のERK活性化も減弱します。
また、ROCKの阻害は、LIPUSによる脂肪分化抑制効果と骨分化促進効果の両方を打ち消すことが確認されています。これらの結果から、ROCK→Cot/Tpl2→MEK→ERKという一連のシグナル伝達経路が、LIPUSの生物学的効果を媒介する主要な経路であると結論づけられています。
メカノトランスダクション：機械刺激から生化学シグナルへ
LIPUSの作用機序を理解する上で、もう一つ重要な概念が「メカノトランスダクション」です。これは、細胞が機械的な刺激を感知し、それを生化学的なシグナルに変換するプロセスを指します。
LIPUSは、組織を通じて伝播する超音波波動として細胞に届きます。この超音波は、骨折部位において「ナノモーション」と呼ばれる微小な機械的変位を引き起こすことが報告されています[12]。この機械的刺激は、細胞表面に存在するインテグリンと呼ばれる受容体によって感知されると考えられています。
インテグリンは、細胞外マトリックスと細胞骨格を結びつける膜貫通型の受容体であり、機械刺激のセンサーとして機能することが知られています[13]。LIPUSによる超音波刺激がインテグリンを介してROCKを活性化し、それが前述のシグナル伝達カスケードを引き起こすというモデルが提唱されています。
興味深いことに、骨細胞（osteocytes）は特に機械刺激に対して感受性が高く、LIPUSの効果発現において中心的な役割を果たしている可能性が示唆されています[14]。骨細胞は骨マトリックス内に埋め込まれた状態で存在し、骨全体の90%以上の細胞を占めています。これらの細胞が形成するネットワークを通じて、機械刺激が骨組織全体に伝達されると考えられています。
PPARγ2リン酸化の二重制御機構
LIPUSによる脂肪分化抑制のメカニズムをさらに詳細に見ていくと、PPARγ2の制御が遺伝子発現レベルとタンパク質修飾レベルの両方で行われていることが分かります。
前述の通り、LIPUSはPPARγ2遺伝子の発現を抑制しますが、同時にPPARγ2タンパク質のリン酸化も促進します。このリン酸化は、特にセリン112番の残基で起こることが報告されており、このリン酸化によってPPARγ2の転写活性が負に制御されることが知られています。
重要なことに、このPPARγ2のリン酸化も、ROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK経路を介して制御されていることが示されています。ROCK阻害剤、Cot/Tpl2阻害剤、あるいはMEK阻害剤のいずれを用いても、LIPUSによるPPARγ2のリン酸化が抑制されることが確認されています。
このように、LIPUSは同一のシグナル伝達経路を通じて、脂肪分化のマスター制御因子であるPPARγ2を転写レベルと翻訳後修飾レベルの両方で制御することにより、脂肪分化を効果的に抑制していると理解できます。
「セリン112番」は、特定のタンパク質を構成するアミノ酸の特定の場所（112番目のセリン残基）を指します。文脈によってどのタンパク質かが異なりますが、特に生化学の分野ではBADタンパク質のセリン112番を指すことが多いです
他のシグナル伝達経路との関連
ROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK経路は、LIPUSの効果を媒介する主要な経路ですが、MSCsの分化制御には他にも多数のシグナル伝達経路が関与していることが知られています。
例えば、Wnt/β-カテニンシグナル経路は、骨分化を促進し脂肪分化を抑制する重要な経路として確立されています[15]。また、骨形成タンパク質（BMP）シグナルも、MSCsの分化において重要な役割を果たしています。これらの経路とLIPUSによって活性化されるERK経路がどのように相互作用し、統合的に細胞の運命決定を制御しているのかについては、今後さらなる研究が必要とされています。
また、p38 MAPキナーゼ経路もMSCsの分化において役割を果たすことが報告されています。特に、脂肪前駆細胞においては、LIPUSがERKの活性化を抑制し、p38 MAPキナーゼの活性化を促進することで、細胞増殖を抑制しアポトーシスを誘導することが示されています[16]。このことは、LIPUSの効果が細胞種や分化段階によって異なる可能性を示唆しており、きめ細かい調節機構の存在を示しています。
臨床的意義と応用の可能性
LIPUSの分子機序が明らかになってきたことは、臨床応用の観点からも重要な意味を持ちます。現在、LIPUSは主に骨折治療において使用されていますが、その適応範囲を拡大できる可能性が見えてきています。
まず、骨粗鬆症の予防や治療への応用が考えられます。前述の通り、MSCsが脂肪細胞ではなく骨芽細胞へと分化することを促進できれば、骨量の維持・増加につながる可能性があります。特に、高齢者や閉経後の女性など、骨粗鬆症のリスクが高い集団において、LIPUSが予防的な介入手段となり得るかもしれません。
また、骨折の治癒促進においても、より効果的な使用法の開発が期待できます。臨床研究では、LIPUSが新鮮骨折の治癒を促進することが多くの報告で示されている一方で、髄内釘を用いた脛骨骨折では明確な効果が認められなかったという大規模試験の結果もあります[17]。このような結果の違いは、骨折の種類、固定方法、あるいは患者背景によって、LIPUSの効果が異なる可能性を示唆しています。
さらに、糖尿病患者や喫煙者など、骨折治癒が遷延しやすいハイリスク患者において、LIPUSが特に有効である可能性が示唆されています[18]。これらの患者群では、Rac-1経路の活性化を介してLIPUSが有益な効果を発揮する可能性が考えられています。
用量依存性と治療パラメータの最適化
LIPUSの効果は、その物理的パラメータ、特に強度と照射時間に依存することが知られています。多くの臨床研究では、平均強度30 mW/cm²、1.5 MHzの搬送周波数、1 kHzのパルス繰り返し周波数、1日20分間の照射という標準的なプロトコルが用いられてきました[19]。
しかしながら、これらのパラメータが最適であるかどうかについては、まだ議論の余地があります。細胞種や分化段階、あるいは治療目的によって、最適なパラメータが異なる可能性があります。例えば、脂肪由来幹細胞の骨分化を促進する際には、デューティ比20%が50%よりも効果的であったという報告もあります[20]。
今後、LIPUSのパラメータを細かく調整し、各病態や治療目的に応じた最適化を行うことで、より高い治療効果を得られる可能性があります。分子メカニズムの理解が進んだことで、このような最適化を合理的に進めることができるようになってきています。
併用療法の可能性
LIPUSの効果をさらに高める方法として、他の治療法との併用も検討されています。例えば、経皮的二酸化炭素適用とLIPUSを併用することで、単独療法よりも骨折治癒が促進されることが動物実験で示されています[21]。
今後の研究課題と展望
LIPUSの分子機序について多くのことが明らかになってきましたが、まだ解明すべき課題も残されています。
まず、in vivoでの詳細なメカニズム検証が必要です。これまでの多くの知見は培養細胞を用いた研究から得られたものであり、生体内の複雑な環境において同様のメカニズムが働いているかどうかを確認する必要があります。特に、骨折治癒過程における各段階で、どのような細胞種がLIPUSに応答し、それがどのように組織全体の修復につながるのかを理解することが重要です。
また、個体差や病態による効果の違いについても、さらなる研究が必要です。なぜ一部の患者でLIPUSの効果が得られないのか、どのような因子が効果を修飾するのかを明らかにすることで、より適切な患者選択や治療計画の立案が可能になるでしょう。
さらに、LIPUSが持つ他の生物学的効果についても、引き続き探索する価値があります。例えば、免疫調節作用や炎症制御作用など、骨形成以外の側面でもLIPUSが有益な効果を持つ可能性が示唆されています。これらの多面的な効果を統合的に理解することで、LIPUSの新たな臨床応用の道が開けるかもしれません。
技術的な側面では、LIPUSの送達方法の改良も重要な課題です。現在の装置では、深部の骨にどの程度効率的に超音波が到達しているのか、また組織による減衰がどの程度あるのかなど、不明な点が残されています。より効率的な送達システムの開発により、治療効果の向上や治療時間の短縮が期待できるかもしれません。
おわりに
LIPUSは、物理的刺激という非薬物的アプローチで骨形成を促進する治療法です。
近年の研究により、その作用機序としてROCK-Cot/Tpl2-MEK-ERK経路を介したMSCsの分化制御が明らかになってきました。
この経路の理解は、単に学術的な興味にとどまらず、より効果的な治療法の開発や、新たな臨床応用の可能性を示唆するものです。今後、基礎研究と臨床研究の両面からさらなる知見の蓄積が進むことで、LIPUSがより多くの患者さんの治療に貢献できることを期待したいと思います。
骨粗鬆症や骨折治癒不全など、骨に関連する疾患は、高齢化社会においてますます重要な医療課題となっています。LIPUSのような非侵襲的で副作用の少ない治療法の発展は、これらの課題に対する一つの解決策となる可能性を秘めています。分子メカニズムの理解を基盤として、個々の患者さんに最適化された治療戦略を構築していくことが、今後の重要な方向性になるものと考えられます。
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